Atividade PCR em Tempo Real

Identificação do grupo

Preencham os dados abaixo. Depois de iniciar, as etapas serão liberadas uma por vez. As respostas ficam salvas neste navegador.

Grupo

Integrantes

Atenção: baixem as respostas ao final. Este arquivo não envia automaticamente as respostas ao professor.

Etapa 1 - Do RNA ao resultado de PCR em tempo real

Um laboratório quer avaliar a expressão do gene BRCA1 em duas amostras celulares. Antes de interpretar Ct, é preciso organizar o fluxo de trabalho.

Ordenem as etapas abaixo de 1 a 6.

Etapa	Ordem	Por que essa etapa é necessária?
Realizar a PCR em tempo real com primers específicos.
Extrair RNA das células.
Comparar os valores de Ct do gene-alvo com um gene de referência.
Converter RNA em cDNA usando transcriptase reversa.
Coletar fluorescência a cada ciclo e definir o threshold.
Avaliar controles e qualidade da reação.

Síntese da etapa: por que, em análise de expressão gênica, geralmente se começa com RNA e não diretamente com DNA genômico?

Etapa 2 - Ct, gene de referência e interpretação de expressão

Dados de uma RT-qPCR para BRCA1. O gene ACTB foi usado como referência.

Amostra	Ct BRCA1	Ct ACTB
Amostra Tumoral A	22	18
Amostra Tumoral B	27	18
Amostra Controle	24	18

1. Qual amostra tem maior expressão relativa de BRCA1? Justifiquem usando Ct/Delta Ct. 2. Qual amostra tem menor expressão relativa de BRCA1? Justifiquem. 3. Comparando A com B, quantos ciclos de diferença existem para BRCA1? Isso sugere aproximadamente quantas vezes de diferença? 4. Por que é importante usar um gene de referência? Síntese da etapa: escrevam a regra geral entre Ct, Delta Ct e expressão relativa.

Etapa 3 - Escolha do sistema de detecção: SYBR Green ou TaqMan

Para cada situação, escolham o sistema mais adequado e expliquem.

Situação	Escolha	Justificativa
Orçamento limitado; aceita fazer curva de melting depois.
Precisa diferenciar uma sequência-alvo específica usando sonda complementar.
A reação gerou fluorescência, mas a curva de melting mostrou dois picos.
Usa repórter e quencher; o sinal aumenta quando a sonda é degradada na extensão.

Síntese da etapa: por que fluorescência não significa automaticamente que o produto amplificado é o correto?

Etapa 4 - Controle de qualidade da placa

Uma placa de PCR em tempo real apresentou os seguintes resultados:

Poço	Amostra/controle	Ct	Melting
A1	Controle positivo	19	Pico único
A2	Controle negativo sem DNA	34	Pico pequeno
A3	Amostra 1	21	Pico único
A4	Amostra 2	30	Dois picos
A5	Amostra 3	Sem Ct	Sem pico

1. O que o resultado do controle negativo sugere? 2. Quais amostras poderiam ser liberadas com maior segurança? Justifiquem. 3. Quais resultados deveriam ser repetidos antes da liberação? Justifiquem. 4. Cite dois erros técnicos que poderiam gerar resultados alterados. Síntese da etapa: escrevam uma regra de decisão para aceitar ou rejeitar uma corrida de qPCR.

Etapa 5 - Caso aplicado: monitoramento molecular

Um ambulatório usa PCR em tempo real para acompanhar um marcador molecular. Quanto menor o Ct, maior a quantidade inicial do alvo.

Paciente	Resultado anterior	Resultado atual	Observação
Paciente 1	Ct 31	Ct 24	Melting com pico único
Paciente 2	Ct 23	Ct 29	Melting com pico único
Paciente 3	Sem Ct	Ct 36	Sinal muito tardio
Paciente 4	Ct 25	Ct 25	Controle interno adequado

1. Qual paciente apresentou aumento mais preocupante do alvo molecular? Justifiquem. 2. Qual paciente parece ter redução do alvo molecular? Justifiquem. 3. Como interpretar o Paciente 3? O resultado pode ser liberado sem ressalvas? 4. Por que uma diferença de vários ciclos pode representar uma grande diferença biológica? 5. Que informações clínicas ou técnicas vocês pediriam antes de tomar uma decisão final? Síntese final: escrevam um mini-parecer do grupo com conclusão, evidência e limitação.